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——新型基于單分子級別熒光共振能量轉移(smFRET)的動態結構生物學共聚焦顯微鏡系統
量化單分子和時間分辨熒光技術，為很多生命科學與材料科學領域提供了新的視野。迄今為止，因為其數據采集和分析需要具備較為專業的背景知識，使得該技術的普及非常緩慢。現在，PicoQuant可以提供一款全新的共聚焦顯微系統——單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa，它具備先進的軟硬件組合，在簡化日常操作流程的前提下，能有效的為操作者呈現高質量的實驗數據。其配備的軟件為每種應用技術都設定了標準化的引導操作流程。
本文將為您介紹單光子計數共聚焦顯微鏡Luminosa系統如何簡化單分子熒光共振能量轉移(smFRET)的實驗過程。
共聚焦熒光顯微鏡在過去四十年中越來越受歡迎，因為其可視化動態過程和細胞結構，使其成為一種用于分子、細胞和發育生物學的常規主力儀器。除了成像之外，點測量相關的實驗方法，例如熒光相關光譜(FCS)和單分子熒光共振能量轉移(smFRET)也在生物物理學領域日漸普及。最近發展起來引入時間分辨的實驗方法更是頗為引人注目。
對熒光基團熒光壽命的測量，揭示了新的信息維度，可以和光譜信息相互補充。每個熒光基團的熒光壽命信息是只有的，因此可以作為多重檢測的識別特征。它同時也可以被單分子間的熒光共振能量轉移所影響，例如，由于受體的存在導致供體壽命下降而反應出的熒光共振能量轉移效率。
迄今為止，使用時間分辨熒光技術的門檻相對較高，需要專業的背景知識。而全新的單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa大大降低了使用門檻，并且將多種時間分辨工具集成統一。并為以下研究領域提供新的視野:
?單分子級別的動態結構生物學
?相位分離引起的細胞機制
?環境監測
?細胞膜的動態和結構成像
?功能性的納米囊泡特性檢測
?研究單分子級別下的化學反應
?先進材料的特性表征
?質量和穩定性檢測
在這些研究領域中，實驗復現是一個難題。可能的原因之一在于所使用的顯微方法的細節描述不充分。為了提升準確性，可重復性以及實驗質量，通過顯微系統的自動化來減少人為誤差是一個潛在的可行方案，例如，硬件部件的自動化，以及將傳感單元集成到智能軟件中。這也增加了成像系統的易用性，總而言之，為研究人員節省了寶貴的時間和材料。此外，自動化提高了通量，甚至開辟了新的實驗可能性，如延時成像、多位置成像或多點時間軌跡。
單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa在壽命測量領域有著最佳的性能表現。該顯微系統同樣對于單分子靈敏度進行了優化，可以進行單分子級別的各種實驗。我們通過MicroTime200系統的實驗經驗設計了這個全新的顯微鏡系統，并為它挑選了一批最佳硬件組合。通過精簡和優選后的光學元件使得該系統達到了很高的靈敏度水平。
用戶既可以選擇使用高速的振鏡系統進行掃描成像，也可以一鍵切換為壓電平移臺的物鏡掃描模式。這種切換功能目前在其他顯微系統中是沒有的。壓電掃描成像避免了振鏡掃描模式下的信號損失，根據波長的不同，大約可以提升20-30%左右的光子信號。用戶同時也可以選擇時間響應更優秀的混合式光電倍增管探測器，或者高探測靈敏度的單光子雪崩二極管作為定制配置。
單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa軟件是從頭開始創建的。它的設計使其工作流程簡單快捷，使用戶能夠更加專注于樣品特性本身。良好的交互界面布局，清晰排列的界面僅顯示與每個應用相關的參數，保證了測量數據的重復精度。單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa軟件包括smFRET功能，FCS熒光相關光譜，以及時間分辨成像功能，同時也具備有自定義測量和分析模式。
系統只需單擊一個按鈕，在不到一分鐘的時間內，便可完成無樣品自動對準。對準非常準確，無需進一步優化即可直接進行FCS熒光相關光譜測量，所以通過簡單的操作就可以確保系統始終處于相同的最佳狀態。
開始操作時，用戶選擇在下一個實驗中使用哪種測量技術方法。軟件中清晰排列的軟件界面僅顯示該類型測量所需的參數，從而將意外錯誤的風險降至最小。根據選擇樣品中存在的熒光團，硬件會自動正確配置。然后根據實驗環境分配分析通道。大多數商用LSM共聚焦顯微系統中已經提供了類似的功能，但是現在還設置了對時間分辨測量很重要的其他參數（例如激光的重復頻率），從而減少對用戶所需專業知識的要求。設置的保存和加載，保證了測量的可重復性。此外，適當的原始數據與實際數據一起保存，方便以后查詢使用。
圖2. 使用532nm和640 nm脈沖交錯激發和雙通道檢測的smFRET實驗的硬件和分析設置屏幕截圖，產生三個邏輯分析通道。
激發光的功率校準模塊同時可以提供設置和顯示激發功率(單位μw，如圖2)的功能，并且不需要額外的功率測量設備。自動調節耗時不到十秒，而且可以在不移動樣品的情況下連續進行。參考文獻[2]表明了激發光強的精確控制在可重復精度中的重要性，例如它會影響到光漂白，光毒性等等，從而在結果中引入不確定性。 這個問題對實驗的影響非常大， QUAREP - LiMi (光顯微鏡質量和重復精度評估組織)也將激發光功率的控制放在工作的首要位置。
在實驗進行測量時，會實時顯示多個在線預覽。這樣用戶就可以把控樣品的情況，從而進一步進行正確的采集參數設定。在線實時分析實際上是一種動態幫助信息，旨在提高采集到的數據質量。
新軟件結合了用于熒光壽命成像(FLIM)，熒光相關光譜(FCS)和單分子檢測的GPU加速算法。 強大的算力使得其可以實現自動分析程序，并將有關實驗類型、硬件配置、熒光團和數據維度的信息考慮在內，因此無需用戶交互即可獲得初始結果。盡管如此，原始數據保持不變，以便于以后可以使用不同的參數設置重新分析。
圖3. 典型的smFRET應用 - 研究蛋白和DNA的作用
單分子研究，以及更具體的smFRET方法學，已成為研究蛋白質和核酸動態結構變化的標準工具。這些實驗方法可以揭示在納秒到秒級別的時間維度上的動態活動過程。例如成鏈動力學，蛋白的結合，折疊，探測變構信號，寡聚化以及聚集現象，如圖3所示。實驗結果對其他實驗方法，例如電鏡，核磁共振等，進行了有效的補充。這樣完整的數據就可以被歸檔到到綜合結構模型的存檔系統PDB-Dev [3]。近年來，內在無序蛋白質的生物學相關性研究越來越多，突出了這些方法的力量。
smFRET測試既可以在分子自由移動的溶液中進行，也可以對分子固定在蓋玻片表面上的樣品實施探測。單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa為兩種樣品分別提供了專門的工作流程。
選擇正確的FRET對信息后，硬件會自動切換到對應的配置，即設置激發波長和功率，啟用供體和受體的脈沖交錯激發，并選擇正確的檢測器和發射濾光片，如圖2所示。此外，系統會根據實驗條件選擇分析通道：供體激發后的供體發射，供體激發后的敏化受體發射和直接受體激發后的受體發射作為對照。可以選擇不同的停止條件進行采集。例如，在分子溶液樣品測試時，停止條件可以是爆發發射數量、總時間、爆發頻率的減少量等等。這有助于收集具有充分統計數據的一致數據集。
采集數據時會顯示四種在線數據預覽: FRET效率（E）與化學計量（S）的直方圖、爆發直方圖、強度時間軌跡和TCSPC直方圖，以及用于供體和受體壽命衰減的在線擬合。E和S在線計算并顯示在E/S直方圖中。根據[4]中的數據處理標準步驟，這些在線數據通過四種因子進行校正。這些校正因子分別是：光譜串擾因子α，激發波動因子β，探測效率因子γ以及直接激發因子δ。校正后以及未校正數據都在圖4中有所顯示，這樣就可以評估校正步驟帶來的影響，這些因子在隨后都可以手動進行修改。
圖4. E/S直方圖將單個FRET爆發的值顯示為單個點，綠色為校正后的曲線，紅色為未校正曲線。
分子穿過固定的激光聚焦光斑時，所發出的熒光信號被采集。這些信號可以連同共聚焦針孔大小來確定聚焦光斑的體積。觀察時間窗口，例如，爆發持續時間是由聚焦體積來決定的。在衍射極限級別的聚焦體積下，極短時間內就有高量級的光子產出，可以被用于監控快速的分子動態過程。增大聚焦體積的同時會延長爆發持續時間，如圖5所示。這樣就可以觀察慢速分子的動態過程和測量大分子較緩慢的擴散特性。總體上說，如[5]中表述的，“更大的聚焦體積，結合高功率的激發，每個爆發持續時間能產出最高的光子量級"。單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa能夠根據激發波長的不同，將觀察體積從衍射極限的3倍增加到6倍。在軟件中點擊一個按鈕，可以減小激發光束直徑，對物鏡進行下充，相應調整光路和共焦探測針孔的大小，從而增加有效觀測體積。
圖5. 爆發持續時間對比圖，紅色為較大聚焦體積下，藍色為較小聚焦體積下。
在研究分子固定在表面的樣品時，用戶既可以選擇壓電掃描臺來獲得更多的光信號，也可以選擇振鏡掃描方式來快速成像。樣品自動保持對焦，而平鋪和拼接可實現大面積成像，如圖6所示。
圖6. 用Cy3B和Atto647N標記的單DNA折紙固定在表面上。九張成像圖片拼接成了一張21x21µm的圖像。右圖：單張小圖的FLIM分析結果。上圖：平均壽命圖。下圖：多指數壽命擬合結果疊加圖。樣品數據由弗里堡大學，物理學院提供。
采集到一個成像圖塊后，通過自動算法在特定標準下，測算出單分子的位置。隨后對這些單分子進行逐個探測，并在停止條件達到之前記錄其光強隨時間變化的數據。然后，下一個圖塊區域將被掃描和成像，以此類推。通過這種方式，可以輕松獲得具有足夠統計數據的數據集。
單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa的自動化工作流程提高了系統的易用性并減少了人為錯誤，從而節省了研究人員的寶貴時間和樣品材料。重要的是，自動設置的參數值可以保存為元數據，而在手動系統中，必須手動記錄這些值。綜上所述，與手動操作的系統相比，該系統提高了實驗的精確度、可重復性和實驗質量。但是，審查配置和設置（例如染料數據庫條目或丟棄事件的閾值）以確保它們適合新實驗仍然是很重要的。
許多專業的知識應用于制定系統的工作流程和參數設定中，所以實際使用人員并不需要具備相關專業知識。即便如此，在樣品制備和數據闡釋方面，用戶仍然需要一定的知識儲備。
PicoQuant持續研發新的熒光顯微鏡科研工具，例如光譜分辨FLIM系統，結合了壽命和光譜信息，可同時并行多目標成像，詳情參閱文章[6]和[7]。PicoQuant同時活躍于各種與學術界合作的研究項目中，來拓展新型顯微系統的概念和實驗方法。例如，NG-FLIM計劃，旨在實現一種高空間分辨率和高時間分辨率的顯微系統，這樣可以更加簡便和精確的在活體細胞和組織中快速觀察膜受體的情況。不同的光學方法再結合起來以提高成像的對比度，基于深度學習的數據處理方式用于自動化的數據評估。這項計劃的參與者包括PicoQuant、Nanotag Biotechnologies、Arivis、哥廷根大學以及哥廷根中心醫藥大學。該計劃由德國聯邦教育和研究部的"Photonics Research in Germany"項目(項目編號 13N15324)撥款。另一個例子就是糾纏態的雙光子吸收，可以被應用于化學選擇性熒光顯微鏡。PicoQuant正與弗勞恩霍夫應用光學和精密工程研究所、M Squared Lasers以及耶拿大學一起合作研究此主題。該方向同樣由德國聯邦教育和研究部支持，隸屬于LIVE2QMIC(13N15953)研究項目。
PicoQuant的新型單光子計數共聚焦顯微鏡系統Luminosa可以幫助研究者輕松的將單分子時間分辨熒光顯微實驗方法廣泛應用于生命和材料科學研究領域，而不需要操作者本身具備豐富的經驗。得益于新的軟件功能與先進的硬件相結合，并且更好地集成了硬件和軟件，該系統以可重復的方式快速提供高質量的數據。這使研究人員能夠自信地采用smFRET等新方法，從新的角度觀察樣品。
[1] M.Baker: 1,500 scientists lift the lid on re-producibility，Nature 533 (2016) 452–454。
[2] P.Montero Llopis et al.: Best practices and tools for reporting reproducible fluores-cence microscopy methods，Nat Methods 18 (2021)1463–1476。
[3] E.Lerner，A. Barth，J.Hendrix et al.: FRET-based dynamic structural biology: Challenges， perspectives and an appeal for open-science practices.Ashok.(2021) eLife 10:e60416。
[4] B.Hellenkamp，S.Schmid，O.Doros-henko et al.: Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements – a multi-laboratory benchmark study，Nat Methods 15 (2018) 669–676。
[5] G.Agam，C.Gebhardt，M.Popara et al.: Re-liability and accuracy of single-molecule FRET studies for characterization of struc-tural dynamics and distances in proteins.(2022)bioRxiv 2022.08.03.502619。
[6] T.Nieh?rster et al.: Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging mi-croscopy，Nat Methods 13 (2016) 257–262。
[7] S.Rohilla et al.: Multi-target immuno-fluorescence by separation of antibody cross-labelling via spectral-FLIM-FRET，Sci Rep 10 (2020) 3820。
PicoQuant由四位年輕的科學家和工程師于1996年成立，致力于發展真正為科學家所使用的光學儀器。該公司注重于在眾多科學領域為各國科研工作者提供創新型和高質量的產品。 PicoQuant不忘初衷，砥礪前行，現已成為時間分辨光學測量領域的行業者。
Maria Loidolt-Krüger曾就讀于凱澤斯勞滕大學生物物理系，并在哥廷根普朗克研究所的Stefan Hell小組獲得碩士和博士學位，專業方向圍繞STED顯微系統的進一步開發。2018年畢業后即加入PicoQuant公司，成為顯微應用專家。2022年作為PicoQuant公司科學內容創作者。同時也在柏林應用科技大學兼職講師，主要方向為光顯微學。
